Faisabilité d'une méthode de dosage électrochimique intégré d'activités protéolytiques en milieu plasmatique et sang total

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  • Section publique

    Thèse doctorat 2005 FR

    Catégorie : Chimie physique

    Ecole doctorale sciences et ingéniérie

    Auteur : Guillaume Lamblin

    Directeur de thèse : sous la direction de Jean-Maxime Nigretto

    Publication autorisée par le jury

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    Résumé : La faisabilité d'une méthode de dosage électrochimique intégré d'activités protéolytiques a ainsi été examinée en vue de mettre au point un biocapteur miniaturisable. Cette méthode opère par détection électrochimique d'une sonde redox libérée par le clivage enzymatique de substrats peptidiques immobilisés par une monocouche auto-assemblée (SAM).Pour déterminer les conditions optimales de la fixation de la monocouche peptidique, nous avons varié les conditions de dépôt. L'électrochimie de marqueurs redox, la spectroscopie infrarouge et la spectrométrie de masse MALDI-TOF ont été utilisées pour obtenir des informations qualitatives sur les SAM élaborées. La quantification directe de thiols immobilisés a été réalisée par l'intégration des pics de désorption électroassistée de la SAM en milieu basique et par la variation de la fréquence de résonance enregistrée par microbalance à quartz. Nous montrons que les propriétés de l'interface SAM de peptides/solution (structure, nombre de défauts, cinétique de formation) diffèrent selon le solvant, la température, le temps de dépôt, et l'état de surface du substrat d'or utilisé. Les peptides affectent le transfert électronique comme l'indiquent les résultats contrastés obtenus avec les différents marqueurs redox. Deux interprétations, basées respectivement sur la thermodynamique et la cinétique du transfert électroniques, sont proposés. Après avoir optimisé le dispositif expérimental et établi, par simulation numérique, la sensibilité suffisante de la méthode de détection, la réactivité des monocouches élaborées dans les différentes conditions a été testée avec la trypsine et la thrombine. Nous montrons qu'il n'y a aucune réaction enzymatique entre le dépôt et les enzymes. D'autre part, des expériences complémentaires révèlent l'absence d'adsorption. Ces résultats nous ont conduits à envisager une première stratégie visant, par l'élaboration de SAM mixtes, à diminuer la compacité des peptides exposés. Dans un deuxième temps, une approche expérimentale a consisté à utiliser de nouveaux substrats comportant un bras espaceur hydrophile et flexible, associés en SAM mixtes, de manière à pallier la rigidité et/ou l'hydrophobie probable des monocouches. Nous présentons les premiers travaux effectués.

    Résumé : The feasibility of an integrated electrochemistry method for the proteolytic activity measurement has been examined with a view to develop a biosensor. It involve the electrochemical detection of a redox probe that is released from the enzymatic cleavage of peptide substrate immobilized with a self-assembled-monolayer (SAM). In order to know the optimum conditions of the peptide monolayer fixation, we have changed the experimental conditions of the deposit. Qualitative information arise from electrochemistry of redox probe, infrared spectroscopy and MALDI-TOF spectrometry. Quantitative measurement of immobilised thiols come from integration of voltametric desorption peaks of the SAM in basic media and from the variation of the resonant frequency in quartz-crystal microbalance.We show that the propriety of the SAM/solution interface (structure, defaults number, kinetic formation) change with the solvent, temperature, time deposit and surface state of the gold use. As it can be seen from the contrasted results obtained with the redox probes, the peptide affect the electronic transport. We propose two interpretations in order to explain this, one thermodynamic based and other electronic transfer kinetic based. After optimisation of the experimental device and demonstration with numerical simulation that the sensibility of the detection method is sufficient, the monolayer reactivity in various conditions has been tested with trypsin and thrombin. We show that there is no enzymatic reaction between the deposit and the enzyme. Complementary experiences reveal no adsorption. These results drive us to envisage a first new strategy that use the mixed SAM, where the compacity of the exposed peptides is diminished. In a second time, an experimental approach has consisted to use new substrates with a hydrophile and flexible spacer arm, assembled in mixed SAM, in order to modify the rigidity and hydrophilicity expected of the monolayer. We present the firsts works made.

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